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產(chǎn)品詳情
  • 產(chǎn)品名稱:豬瘦素(LEP)ELISA試劑盒

  • 產(chǎn)品型號(hào):LEP
  • 產(chǎn)品廠商:KALANG
  • 產(chǎn)品文檔:
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簡(jiǎn)單介紹:
豬瘦素(LEP)ELISA試劑盒運(yùn)用雙抗體夾心ELISA法定量測(cè)定豬血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和其他生物液體中豬瘦素(LEP)ELISA試劑盒含量。
詳情介紹:


                                                                 96T                僅供體外研究使用,不用于臨床診斷!

豬瘦素(LEP)ELISA試劑盒

本試劑盒運(yùn)用雙抗體夾心ELISA法定量測(cè)定豬血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和其他生物液體中豬瘦素(LEP)含量。

 檢測(cè)范圍

0.313-20ng/mL

 *低檢測(cè)限

0.124ng/mL

 實(shí)驗(yàn)原理

豬瘦素(LEP)抗體包被于96孔微孔板中,制成固相載體,向微孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)本,其中的豬瘦素(LEP)與連接于固相載體上的抗體結(jié)合,然后加入生物素化的豬瘦素(LEP)抗體,將未結(jié)合的生物素化抗體洗凈后,加入HRP標(biāo)記的親和素,再次徹底洗滌后加入TMB底物顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成*終的黃色。顏色的深淺和樣品中的豬瘦素(LEP)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(O.D.),計(jì)算樣品濃度。

 試劑盒內(nèi)容

試劑名稱

數(shù)量

試劑名稱

數(shù)量

96孔板(預(yù)包被)

1

96孔板覆膜

2

標(biāo)準(zhǔn)品

0.5ml×1

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

1.5ml×1

顯色劑A

6ml×1

樣品稀釋液

6ml×1

顯色劑B

6ml×1

終止液

6ml×1

酶標(biāo)試劑

6ml×1

密封袋

1

濃洗滌液(30×)

1×20mL

使用說(shuō)明書(shū)

1

豬瘦素(LEP)ELISA試劑盒需自備的設(shè)備及試劑

1.         450±10nm濾光片的酶標(biāo)儀(建議儀器使用前提前預(yù)熱)

2.         單道或多道微量加液器及吸頭

3.         稀釋樣品的EP

4.         蒸餾水或去離子水

5.         吸水紙

6.         盛放洗液的容器

 試劑盒的儲(chǔ)存及有效期

1.         未開(kāi)封的試劑盒:所有試劑均按試劑瓶標(biāo)簽上所示保存。請(qǐng)注意,收到試劑盒后請(qǐng)盡快將TMB 洗滌液,終止液保存于4℃,其他試劑保存于-20℃。

2.         使用后的試劑盒:剩余試劑仍需按照試劑瓶標(biāo)簽所示的溫度保存,開(kāi)封后的酶標(biāo)板要加干燥劑后密封保存于-20℃,避免潮濕。

注意:

試劑盒內(nèi)酶標(biāo)條可拆卸,按實(shí)驗(yàn)需求可分多次使用;使用后的剩余試劑盒建議在**實(shí)驗(yàn)后 1個(gè)月內(nèi)使用完畢。產(chǎn)品過(guò)期時(shí)間以盒子上的標(biāo)簽為準(zhǔn),保質(zhì)期內(nèi)所有組分都確保是穩(wěn)定的。

豬瘦素(LEP)ELISA試劑盒標(biāo)本的采集與保存

1.         血清

將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置 2 小時(shí)或 4oC 過(guò)夜,然后 1000×g 離心 20 分鐘,取上清即可,或?qū)⑸锨逯糜?span>-20oC -80oC 保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2.         血漿:

EDTA 或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本,并將標(biāo)本在采集后的 30 分鐘內(nèi)于 2-8oC 1000×g 離心 15 分鐘,取上清即可檢測(cè),或?qū)⑸锨逯糜?span>-20oC -80oC 保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3. 組織勻漿:

1) 取適量組織塊,于預(yù)冷PBS0.01mol/L, pH 7.0-7.2)中清洗去除血液,稱重后備用(組織塊較大需先剪碎后再勻漿);

2) 可同時(shí)選用多種勻漿方法達(dá)到較好的破碎效果:首先將組織塊移入玻璃勻漿器,加入5-10mL 預(yù)冷PBS 進(jìn)行充分研磨,該過(guò)程需在冰上進(jìn)行(有條件實(shí)驗(yàn)室可選用機(jī)器勻漿);得到的勻漿液可再利用超聲破碎或反復(fù)凍融 進(jìn)一步處理(超聲破碎過(guò)程中注意冰浴降溫;反復(fù)凍融法可重復(fù)2 次)。

3) 將制備好的勻漿液于5000×g 離心5 分鐘,留取上清即可檢測(cè)。

4. 細(xì)胞裂解液:

1)貼壁細(xì)胞需要先用胰酶消化,離心收集細(xì)胞(懸浮細(xì)胞可直接離心收集);

2)將收集到的細(xì)胞用冷PBS 3 次;

3)物理方法裂解細(xì)胞(可先超聲破碎細(xì)胞,再反復(fù)凍融):

i 超聲破碎:取適量PBS 重懸細(xì)胞,用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液,使細(xì)胞急劇震蕩破裂。

ii 反復(fù)凍融:將待破碎的細(xì)胞在-20 oC 以下冰凍,室溫融解,反復(fù)3 次,使細(xì)胞溶脹破碎。

4)將標(biāo)本于2-8 oC 1500×g 離心10 分鐘,收集上清備用。

5. 細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它生物標(biāo)本:

請(qǐng) 1000×g 離心 20 分鐘,取上清即可檢測(cè),或?qū)⑸锨逯糜?span>-20oC -80oC 保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注意:

1.         以上標(biāo)本均需密封保存4oC保存應(yīng)小于1周,-20oC不應(yīng)超過(guò)1個(gè)月,-80oC不應(yīng)超過(guò)2個(gè)月。

2.         標(biāo)本使用前應(yīng)緩慢均衡至室溫,不應(yīng)加熱使之融解。

3.         實(shí)驗(yàn)前紅細(xì)胞裂解液必須用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋。

豬瘦素(LEP)ELISA試劑盒試劑準(zhǔn)備

1.         使用前將所有的試劑和標(biāo)本緩慢均衡至室溫(18-25oC),試劑不能直接在37oC溶解。

2.         標(biāo)準(zhǔn)品(凍干品):每瓶標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1mL,蓋好后室溫靜置大約10分鐘,同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解,其濃度為20ng/mL。準(zhǔn)備7個(gè)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的EP管,每個(gè)EP管中加入150μL的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液,如圖所示依次倍比稀釋成不同的梯度, 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(0pg/mL)直接作為空白孔。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性,每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

 

 

 

3.         濃洗滌液:用580mL蒸餾水或去離子水將20mL濃洗滌液稀釋至600mL,進(jìn)行30倍稀釋。

標(biāo)本處理

1.         本公司只對(duì)試劑盒本身負(fù)責(zé),不對(duì)因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責(zé),請(qǐng)使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量,預(yù)留充足的樣本。

2.         實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測(cè)標(biāo)本含量,如果標(biāo)本濃度過(guò)高,應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行稀釋,使稀釋后的標(biāo)本符合試劑盒的檢測(cè)范圍,計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

3.         若所檢樣本不包含在說(shuō)明書(shū)所列樣本之中,建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其有效性,并注意留存樣本。

4.         使用化學(xué)裂解液制備的組織勻漿或細(xì)胞提取液可能會(huì)由于某些化學(xué)物質(zhì)的引入導(dǎo)致  ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差。

5.         若樣本為細(xì)胞培養(yǎng)上清,因該類樣本干擾因素 較多,如:細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞數(shù)量、采樣時(shí)間等,所以可能存在檢測(cè)不出的情況。

6.         某些天然蛋白或重組蛋白,包括原核及真核重組蛋白,可能因?yàn)榕c本產(chǎn)品所使用的檢測(cè)抗體及捕獲抗體不匹配,而不被檢測(cè)出。

7.         建議使用新鮮樣本,保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)存在蛋白降解或變性導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差。

豬瘦素(LEP)ELISA試劑盒操作步驟

1.         加樣:分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同)、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl,待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測(cè)樣品10μl(樣品*終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻。

2.         溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。  

3.         配液:將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用

4.         洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。

5.         加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,空白孔除外。

6.         溫育:操作同3

7.         洗滌:操作同5。

8.         顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘.

9.         終止:每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。

10.     測(cè)定:以空白空調(diào)零,450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

注意:

1.         試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備一次實(shí)驗(yàn)所需要的酶標(biāo)條,其它的可從微孔板上拆下,密封,按照說(shuō)明書(shū)要求保存,以備下次使用。

2.         加樣實(shí)驗(yàn)操作中請(qǐng)使用一次性的吸頭,避免交叉污染。加樣時(shí)注意不要有氣泡,將樣品加于酶標(biāo)板底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻。加樣或加試劑時(shí),**個(gè)孔與*后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大,將會(huì)導(dǎo)致不同的“預(yù)溫育”時(shí)間,從而明顯地影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。因此,一次加樣時(shí)間(包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品)*好控制在10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.          溫育為防止樣品蒸發(fā),實(shí)驗(yàn)時(shí)請(qǐng)將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi),以避免液體蒸發(fā),洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作,任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài),同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度。

4.         洗滌:充分的洗滌非常重要,在每次洗滌過(guò)程中,都要將洗滌液完全甩干。洗滌過(guò)程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干,勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水,同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印,避免影響*后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。如果有自動(dòng)洗板機(jī),應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí) 驗(yàn)過(guò)程中。

5.         反應(yīng)時(shí)間的控制加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化(比如,每隔10分鐘觀察一次),如顏色較深,請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),避免反應(yīng)過(guò)強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。

6.         底物底物請(qǐng)避光保存,在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。

7.         如果實(shí)驗(yàn)室內(nèi)濕度低于60%,推薦使用加濕器提高濕度水平。

 實(shí)驗(yàn)流程

1.         實(shí)驗(yàn)前標(biāo)準(zhǔn)品、試劑及樣本的準(zhǔn)備;

2.         加樣(標(biāo)準(zhǔn)品及樣本)50μL,37孵育30分鐘;

3.         洗板5次,加酶標(biāo)試劑50ul37孵育半小時(shí);

4.         洗板5次;加入顯色液A,B50ul,37孵育顯色15分鐘

5.         加終止液50μL,立即450nm讀數(shù)。

6.    計(jì)算

豬瘦素(LEP)ELISA試劑盒計(jì)算

各標(biāo)準(zhǔn)品及樣本O.D.值扣除空白孔O.D.值后作圖(七點(diǎn)圖),如設(shè)置復(fù)孔,則應(yīng)取其平均值計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)(或?qū)?shù)坐標(biāo)),O.D.值為橫坐標(biāo)(或?qū)?shù)坐標(biāo)),繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(*佳方程式應(yīng)依回歸方程計(jì)算的R2值來(lái)定,以R2值越趨近于1為好)。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析,如curve expert 1.30,根據(jù)樣品O.D.值,由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與O.D.值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式,將樣品的O.D.值代入方程式,計(jì)算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。

 特異性

本試劑盒用于檢測(cè)豬瘦素(LEP),經(jīng)檢測(cè)與其它相似物質(zhì)無(wú)明顯交叉反應(yīng)。

由于受到技術(shù)及樣本來(lái)源的限制,不可能完成對(duì)所有相關(guān)或相似物質(zhì)交叉反應(yīng)檢測(cè),因此本試劑盒有可能與未經(jīng)檢測(cè)的其它物質(zhì)有交叉反應(yīng)。

 精密度

精密度用樣品測(cè)定值的變異系數(shù)CV表示。CV(%) = SD/mean×100

批內(nèi)差:取同批次試劑盒對(duì)低、中、高值定值樣本進(jìn)行定量檢測(cè),每份樣本連續(xù)測(cè)定20 次,分別計(jì)算不同濃度樣本的平均值及SD值。

批間差:選取3個(gè)不同批次的試劑盒分別對(duì)低、中、高值定值樣本進(jìn)行定量測(cè)定,每個(gè)樣本使用同一試劑盒重復(fù)測(cè)定8次,分別計(jì)算不同濃度樣本的平均值及SD值。

批內(nèi)差: CV<10%

批間差: CV<12%

豬瘦素(LEP)ELISA試劑盒穩(wěn)定性

經(jīng)測(cè)定,試劑盒在有效期內(nèi)按推薦溫度保存,其活性降低率小于5%。

為減小外部因素對(duì)試劑盒破壞前后檢測(cè)值的影響,實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境條件需盡量保持一致,尤其是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實(shí)驗(yàn)員來(lái)進(jìn)行操作可減少人為誤差。


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